服务介绍：

FISH原位杂交免疫荧光复染试剂盒说明书

货号C009

原 理:

原位杂交技术（in situ hybridization）是 以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子的技术。使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互 补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

本试剂盒使用敏感性加强型的原位杂交检测方法,具有敏感性强,杂交效率高,背景清晰,结果可靠的优点.可以检测常规福尔马林固定,石蜡包埋的标本.

试剂盒组成:

自备试剂：

DEPC、乙酸酐、原位杂交用PBS、RNA Free4%PFA、甘氨酸、甲酰胺、盐酸、二甲苯、乙醇、DAPI、防淬灭封片剂、指甲油、湿盒、杂交仪、鼓风干燥箱、切片机、漂片机、染缸、枪头、移液器、口罩、手套、免疫荧光一抗及相应荧光二抗。

保存温度：请严格按照说明书上的保存温度保存 有效期：6个月

实验流程：

一． 细胞爬片或者冰冻切片

1. 冰冻切片厚度5-8um，用放脱片载玻片；细胞爬片的盖玻片要用多聚赖氨酸处理。防止脱片。

2. 细胞爬片、血液涂片、菌液涂片和冰冻切片均可用下述方法固定：用RNA Free4%多聚甲醛室温固定20-30min，用DEPC水充分水洗，自然干燥后-20℃冷冻可保存2周以上。

3. 制作湿盒：用5×SSC（35ml）+甲酰胺（35ml）置于湿盒内。

4. 30%H₂O₂1份+9份纯甲醇混合液室温处理10min。DEPC水洗3次，每次1min;

5. 切片置于湿盒内，用0.25%盐酸滴于组织上，常温15min，用DEPC水洗2次，每次1min（盐酸可中和带电荷的碱性蛋白，降低背景）

6. 蛋白酶K覆盖组织，分子杂交仪中37℃20min。蛋白酶K可以消化和暴露被遮蔽的靶核酸，增加探针的结合效率。

7. 用0.2%或0.1mol/L甘氨酸洗液洗1min（现用现配），终止蛋白酶K。

8. PBS洗两次，每次一分钟。

9. 用4%PFA多聚甲醛固定组织10min。

10. PBS洗三次，每次1min。

11. 用acetic anhydride乙酸酐ph=8.0（乙酰化作用，降低背景）室温洗5min，2次.(乙酸酐溶液配制：每50ml三乙醇胺水溶液中加126ul乙酸酐，现用现配，按比例配制，用多少配多少)。

12. 用PBS洗5次，每次1min。

13. 用5×SSCph7.5洗两次，每次1min。

14. 切片放置湿盒内，用预杂交液 覆盖组织，65℃预杂交 1h。

15. 0.1uM Cy3-labeled pube 探针覆盖切片，在杂交仪内65℃黑暗反应48h。

16. 用2×SSCph=7.5，室温洗1次，1min。

17. 用甲酰胺 加4×SSC pH4.5 1:1混合液在65℃洗三次，每次20min。

18. 用PBS洗5次，每次1min，室温。

19. 将切片置于湿盒内，用封闭液覆盖切片，室温反应至少30min。

20. 滴加免疫荧光一抗抗体，37℃60min反应，PBS洗3遍，每遍5min.

21. 滴加FITC 标记相应的二抗(1:500)，避光37℃30min反应，PBS洗3遍，每遍5min

22. DAPI染核5min，PBS洗3遍，每遍5min。

23. 滴加防淬灭剂，盖盖玻片。指甲油封片，荧光显微镜观察。

二．石蜡切片

如果有条件的话，尽可能采用新鲜标本，及时固定。固定液一定要用RNA Free PFA固定液固定，固定时间为1小时，较大标本不超过2小时。标本较大时用锋利刀片切成厚度不超过4mm的小块。动物大脑固定时间30-40min，一般不超过1小时。

1. 常规脱蜡至水洗。

2. 按照细胞爬片和冰冻切片实验流程3步开始操作。

注意事项：

1. 本试剂盒实验流程中的所有水试剂均用DEPC水配制；

2. 取新鲜标本做冰冻切片前一定要用DEPC水配制的10%蔗糖溶液在4℃冰箱中浸泡过夜，再换用DEPC水配制的30%蔗糖溶液在4℃冰箱中浸泡过夜.然后-80℃冰箱保存或者直接冰冻切片。

3. 由于特定的mRNA序列仅占总序列的极少数，因此原位杂交容易出现非特异性染色，一般通过用不加探针或阴性标本作阴性对照，基本可以确定是否是非特异性染色。如果有明显的非特异性染色现象，可以用预杂交液稀释探针（一般稀释10倍就行），并应加强探针杂交后的洗涤。如果染色部位有出入，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

4. 本试剂盒虽然操作步骤多,繁琐.但是背景干净,非特异染色少!是SCI文章通用的经典方法.可以适用长链的cRNA探针.

5. 试剂盒中的封闭液不可以用5%BSA或2%山羊血清代替。

6. 本试剂盒是原位杂交后做免疫荧光复染，所以标本处理时要兼顾原位杂交和免疫荧光的标本要求。

7. 如果是石蜡切片，请用DEPC水配制的抗原修复液后的标本先做原位杂交再做免疫荧光复染(石蜡切片的效果不好)。

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