服务介绍：

WISH原位杂交试剂盒说明书

货号WISH01

原  理:

原位杂交技术（in situ hybridization）是 以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子的技术。使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互 补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

本试剂盒使用敏感性加强型的原位杂交检测方法,具有敏感性强,杂交效率高,背景清晰,结果可靠的优点.用以检测小组织样本的整体杂交.

本试剂盒适用荧光标记的RNA探针或者荧光标记的单链DNA探针。

试剂盒组成:

自备试剂：

DEPC水、原位杂交用PBS、RNA Free4%PFA、、乙醇、DAPI、防淬灭封片剂、、离心管、杂交仪、枪头、移液器、口罩、手套。

保存温度：请严格按照说明书上的保存温度保存    有效期：3个月

实验流程：

1. 标本梯度酒精脱水（用DEPC水分别配制50%、60%、70%、80%、90%酒精依次处理样本，分别30min;100%酒精2次，每次30min）；

2. 标本用DEPC-PBST（0.1%Tween-20）水化1h;

3. 用1X DEPC-PBST配制6%H2O2漂白1h，冰上操作或者放4℃冰箱；

4. 用1X DEPC-PBST洗涤3次，每次5min；

5. 配制1X Proteinase K 37℃通透20min；

6. 用1X DEPC-PBST洗涤3次，每次5min；

7. 用原位杂交专用PFA室温二次固定20min；

8. 用1X DEPC-PBST（0.1%Tween20）洗涤3次，每次5min；

9. 标本用预杂交液68℃孵育60min；

10.用预杂交液稀释探针，孵育标本，68℃避光孵育48h；

11. 用预热的L1 Buffer 68℃避光洗涤3次，每次30min；

12. 用H1洗液68℃避光洗涤3次，每次10min；

 13. 用L2 Buffer 68℃避光洗涤3次，每次10min；

14. 用L3 Buffer和RNase Buffer 1:1混合液室温避光洗涤5min，

 15. 用RNase Buffe按照1:100稀释RNase母液，用稀释后的母液37℃处理标本1h;;

16. 用Tris/NaCl溶液室温洗涤3次，每次5min，充分洗掉RNase溶液；

17. 染DAPI，10min。

18. 加荧光防淬灭剂避光-20℃保存。体视显微镜拍照。

注意事项：

1. 本试剂盒实验流程中的所有水试剂均用DEPC水配制；

2. 由于特定的mRNA序列仅占总序列的极少数，因此原位杂交容易出现非特异性染色，一般通过用不加探针或阴性标本作阴性对照，基本可以确定是否是非特异性染色。如果有明显的非特异性染色现象，可以用预杂交液稀释探针（一般稀释10倍就行），并应加强探针杂交后的洗涤。如果染色部位有出入，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

3. 本试剂盒虽然操作步骤多,繁琐.但是背景干净,非特异染色少!是SCI文章通用的经典方法.可以适用长链的cRNA探针.

4. 整体原位杂交实验流程长，要注意的细节特别多，规范的实验操作特别重要。

5. 由于实验难度特别大，请注意多收集样本，实验可能有反复。

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