服务介绍：

WISH原位杂交试剂盒说明书

货号WISH06

原  理:

原位杂交技术（in situ hybridization）是 以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异核酸分子的技术。使含有特异序列、经过标记的核酸单链即探针，在适宜条件下与组织细胞中的互 补核酸单链即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细胞原位显示特异的DNA或RNA分子。

本试剂盒使用敏感性加强型的原位杂交检测方法,具有敏感性强,杂交效率高,背景清晰,结果可靠的优点.用以检测小组织样本的整体杂交.

本试剂盒适用于digoxigenin-labeled pube 探针的整体原位杂交。

试剂盒组成:

产品编号	产品名称	包装	保存温度
WISH06A	10X蛋白酶K	5ml	-20℃
WISH06B	预杂交液	50ml	-20℃
WISH06C	MAB buffer	500ml	4℃
WISH06D	封闭液	30ml	-20℃
WISH06E	TSA buffer	20ml	-20℃
WISH06F	荧光染料	25ul	-20℃
WISH06G	抗Dig抗体	10ul	-20℃
WISH06F	HRP Streptavidin	10ul	-20℃

自备试剂：

DEPC水、原位杂交用PBS、RNA Free4%PFA、、乙醇、3%H₂O_2、离心管、杂交仪、枪头、移液器、口罩、手套。

保存温度：请严格按照说明书上的保存温度保存;配制试剂用的PBST一定用无RNA酶的PBS    有效期：3个月

1 L MAB溶液中加入1 mL Tween-20使其终浓度为0.1%（v/v）即为MABT；

1L PBS溶液中加入1 mL Tween-20使其终浓度为0.1%（v/v）即为PBST；

样本固定：

取目标时期的样本用RNAFREE PFA固定液固定1-12h(最好不要超过12h,对比实验证明超过12h对杂交信号有影响)，然后去除固定液，将样本转移到无水甲醇中长时间4度保存（请选择适当的容器，建议用5ml的青霉素瓶为最佳，或者用5ml离心管）并贴好不容易被甲醇溶解的标签。

实验流程：

1. 用75%、50%、25%的甲醇/PBST浸泡样本，使样本复水，每次10min；

2. PBST浸洗1次，3min；

3. 用-20度冰丙酮处理10min，增加膜通透性；

4. PBST洗3次，每次10min，以去除丙酮；

5. 用PBST 1:1000稀释Proteinase K，37℃对样本进行消化。消化时间参照斑马鱼：

受精后0 to 10h 1 min；受精后12 to 14h 3 min；受精后15 to 18h 5 min；受精后18 to 28h 10 min；受精后28 h to 2d 25 min；受精后2d to 3d 45 min

6. 快速用PBST浸洗2次，终止Proteinase K；

7. PBST洗3次，每次20min；

8. 加入预杂交液65℃预杂交2-5h;

9. 将预杂交液中加适量探针即为杂交液（探针浓度视不同样本而不同，需要摸索），杂交液孵育样本加热到80℃5min立即放入冰中变性；

10. 去除杂交液，换新杂交液65℃杂交过夜；

11. 分别用100%、75%、50%、25%预杂交液/2XSSC 65℃浸洗20min，2XSSC65℃浸洗20min1次，0.2XSSC65℃浸洗20min3次；

12. 分别用75%、50%、25%MABT室温浸洗10min，MABT室温浸洗10min；

13. 加适量封闭液室温封闭1h;

14. 加适量抗Dig一抗（1:2000）4℃过夜；

15. 用MABT室温浸洗6次，每次10min；

16. 滴加HRP Streptavidin（1:500）室温孵育30min。PBS洗3次，每次5min；

17. TSA Buffer浸洗10min一次；

18. 荧光染料工作液（荧光染料工作液：1ml TSA Buffer+0.3% H₂O₂ 10ul+2ul荧光染料）进行染色；染色时间视样本大小而定，一般斑马鱼20min。

19. 加PBST浸洗3次，每次5min； 

20. 用PBS稀释DAPI，染核10min；

21. 用PBS浸洗3次，每次10min，洗掉多余的DAPI；

22. 样本短时间4℃保存可以直接放在PBST中避光保存，长期保存可以用PBST/Glycerol4℃避光保存。请及时荧光拍照或荧光扫片。

注意事项：

1. 本试剂盒实验流程中的所有水试剂均用DEPC水配制；

2. 由于特定的mRNA序列仅占总序列的极少数，因此原位杂交容易出现非特异性染色，一般通过用不加探针或阴性标本作阴性对照，基本可以确定是否是非特异性染色。如果有明显的非特异性染色现象，可以用预杂交液稀释探针（一般稀释10倍就行），并应加强探针杂交后的洗涤。如果染色部位有出入，往往和标本固定时间过长有关，应重新处理标本。

3. 本试剂盒虽然操作步骤多,繁琐.但是背景干净,非特异染色少!是SCI文章通用的经典方法.可以适用长链的cRNA探针.

4. 整体原位杂交实验流程长，要注意的细节特别多，规范的实验操作特别重要。

5. 由于实验难度较大，请注意多收集样本，实验可能有反复。

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