服务介绍：

五标六色酪胺信号放大试剂盒TSA

产品货号TSA09

原 理：

酪胺信号放大系统（Tyramide Signal Amplification,TSA）是一种用于检测低丰度或者低表达靶标的信号放大技术。TSA技术可以将检测灵敏度提供50-200倍。

偶联有辣根过氧化物酶（HRP）的二抗和一抗结合后，将邻近区域的荧光染料分子的酪胺基团活化，活化后的染料分子可与靶标分子及靶标分子周围的芳香类氨基酸残基（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等）共价结合并聚集，从而在靶标区域形成高密度荧光信号。由此实现对低丰度靶标分子的检测和荧光成像。

样本可以在抗原修改或者再次通透后进行多重免疫荧光显色，而不受一抗来源限制。

产品包装明细：

自备试剂

一抗、抗原修改液、荧光防淬灭剂、盖玻片、山羊血清、免疫组化笔、H₂O₂等

使用说明：

1. 一抗浓度高低对染色结果有直接影响，建议做预实验，摸索一抗浓度；

2. 荧光染料可以按照1: 200-500稀释，一般1:200就可以达到满意结果。如果低表达的靶标可以适当提供荧光染料浓度；

3. 多重免疫荧光染色建议先孵育多抗后孵育单抗；

4. 由于要多次抗原修复，所以对样本切片要求高，一定要做好前期样本固定包埋工作，保证切到高质量的切片；

实验流程

1、 样本准备

1）、贴壁细胞：细胞培养到实验要求时间点后用PBS洗3次，清洗掉培养基和药物等。

用4%多聚甲醛固定20min，去除固定液PBS洗2遍，蒸馏水洗1遍。放60度烤箱烤片15min。放-20度或者4度长期保存（细胞汇合度60-70%最佳）。

2）、悬浮细胞在收集细胞后离心去上清加适量4%多聚甲醛（PFA）固定20min，去除固定液PBS洗2遍，蒸馏水洗1遍。用适量蒸馏水调整调整细胞浓度，吸取200ul细胞悬液涂在防脱片载玻片上，室温晾干或者60度烤箱烤干。剩余细胞收集后放甲醇中长期保存。涂片细胞密度不要太高

3）、冰冻切片：样本离体后立即放4%多聚甲醛中固定20min，转入15%蔗糖溶液4度冰箱过夜，再转入30%蔗糖溶液中过夜，然后冰冻切片。切片厚度最好控制在5-8um。切片后放60度烤箱烤干，-20度冰箱长期保存。这样处理的冰冻切片可以进行热抗原修复，对于低表达的指标效果更好。

4）、石蜡切片：石蜡切片4um厚度，60度烤箱烤片10min。依次入二甲苯2次，每次8min；无水乙醇2次，每次5min；90%乙醇1次5min；80%乙醇1次5min；PBS洗3遍。

2、 抗原修复：组织切片或冰冻切片入Triste-EDTA pH9.0抗原修复液或者柠檬酸钠pH6.0抗原修复液中热抗原修复。室温放凉后PBS洗3遍，每遍5min。在多重染色是建议第一次抗原修复用Triste-EDTA pH9.0抗原修复液，后续用柠檬酸钠pH6.0抗原修复液。

3、封闭内源性过氧化物酶：用免疫组化笔在样本边缘画圈，防止液体流出。滴加3%过氧化氢溶液，室温避光反应10min，PBS洗3遍，每遍5min。（过氧化氢溶液也可以自己配制，80%甲醇+10%蒸馏水+10%的30%商品化过氧化氢）

4、封闭蛋白非特异结合位点：在样本上滴加一抗稀释液或者0.2%山羊血清溶液，均匀覆盖样本，室温1h或者37℃30min。

5、孵一抗：去掉封闭液直接滴加适当浓度的一抗覆盖样本，37℃反应1h或者4度冰箱过夜。

6、一抗洗脱：PBST洗2遍，每遍5min，PBS洗1遍5min；

7、孵育二抗：用0.2%山羊血清1:500稀释与一抗对应种属HRP标记二抗，直接滴加在样本上，室温反应1h或37℃30min。（实践证明用浓缩型二抗稀释比即用型二抗可靠性更高）PBST洗2遍，每遍5min，PBS洗1遍5min；

8、TSA染色：按照每个样本100ul体积计算反应液体积，并按照下表体积比配制反应液：

滴加染色反应液，室温反应5-10min（染色时间也可以根据靶标分子的丰度适当调整）。PBST洗2遍，每遍5min，PBS洗1遍5min。

9、TSA多重染色：石蜡切片或冰冻切片选用柠檬酸钠pH6.0抗原修复液热抗原修复，细胞爬片选择0.3-0.5% Triton X-100对细胞再次通透，去除前一次染色所使用的抗体后重复3-8步。

10、DAPI染核：DAPI用PBS 1:1000稀释，滴加样本上室温孵育10min，PBS洗3遍，每遍5min。也可以使用实验室自己熟悉的DAPI染色液。

11、用荧光防淬灭剂封片。注意避免产生气泡。-20℃冰箱保存。使用荧光显微镜或其他荧光成像设备拍片或扫片。

说明书下载